载MTX靶向纳米微泡超声造影剂增效HIFU消融对滋养细胞作用的实验研究

【摘要】第一部分载MTX靶向纳米微泡的制备和性能检测目的制备一种包载甲氨蝶呤（MTX）的聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）靶向（人类白细胞抗原-G单克隆抗体，mAbHLA-G）纳米微泡（mAbHLA-G/MTX/PLGA），检测其物理和声学性质。方法采用双乳化法，碳二亚胺连接法和真空冷冻干燥技术制备mAbHLA-G/MTX/PLGA，观察其表形结构，测量粒径电位，包封率和载药量；高强度聚焦超声（HIFU）和普通超声的促发后检测mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡中药物的释放情况；并在不同的浓度梯度（200mg/ml，100mg/ml，50mg/ml，25mg/ml，10mg/ml）和时间梯度（0h，2h，4h，8h，16h，24h，48h）观察其超声显影效果。结果mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡溶于双蒸水后呈淡黄色混悬液，光镜及扫描电镜观察其形态规则，呈球形，大小较均匀，表面有孔稍欠光滑，分散度好。透射电镜负染后可见MTX均匀分布在纳米微泡中心。马尔文激光测量仪检测出mAbHLA-G/MTX/PLGA平均粒径为（477.6±119.7）nm，分散指数0.171，Zeta电位为（-5.62±5.36）mV。高效液相色谱法检测其包封率为44.11±1.27%，载药量为4.41±0.13%(w/w)。HIFU激发后3hmAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡药物累计释放率达到50%，72h后药物累计释放率超过80%；而普通超声促发后72hmAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡药物累计释放率仅为47.8%。体外超声显影实验显示mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡能产生较强的超声回声信号，并随着浓度的变化而变化，且制备的mAbHLA-G/MTX/PLGA超声造影剂性能稳定，在制备完成后24h内各时间点超声显像效果没有统计学差异。结论成功制备了载MTX靶向纳米微泡（mAbHLA-G/MTX/PLGANBs）,其形态规则，大小均匀，分散好。与普通超声相比，HIFU更有效的促进了纳米微泡内药物的释放。mAbHLA-G/MTX/PLGA超声造影剂在体外能增强超声成像，且稳定性好，具有良好的声学性能，是一种具有良好应用前景的多功能超声造影剂。第二部分载MTX靶向纳米微泡联合高强度聚焦超声对滋养细胞作用的体外实验研究目的检测人绒毛膜癌细胞株JEG-3细胞HLA-G蛋白的表达和定位，探讨mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡体外寻靶能力和被细胞吞噬的情况。探讨mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡联合高强度聚焦超声靶向破裂对人绒毛膜癌JEG-3细胞株细胞周期，细胞增殖和侵袭，及诱导凋亡和侵袭相关蛋白表达的影响，为体内实验提供依据。方法体外培养人绒毛膜癌JEG-3细胞株，免疫荧光法检查JEG-3细胞HLA-G蛋白的表达和定位。制备DiI标记的mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡（DiI-mAbHLA-G/MTX/PLGANBs），与JEG-3细胞共孵育，观察纳米微泡的体外寻靶能力和被细胞吞噬的情况，实验分组：（1）mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组，（2）mAbHLA-G预处理后+等量的mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组，（3）MTX/PLGANBs组，共孵育后DAPI染核，采用激光共聚焦显微镜观察纳米微泡的分布情况。mAbHLA-G/MTX/PLGANBs联合HIFU体外治疗实验分为12个组：（1）PBS组，（2）空白PLGANBs组，（3）MTX/PLGANBs组，（4）MTX组，（5）mAbHLA-G/PLGANBs组，（6）mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组，（7）HIFU+PBS组,（8）HIFU+空白PLGANBs组,（9）HIFU+MTX/PLGANBs组（,10）HIFU+MTX组，（11）HIFU+mAbHLA-G/PLGANBs组，（12）HIFU+mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组。通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡和细胞周期的变化，Westernblotting检测凋亡和侵袭相关蛋白Bax，Bcl-2，Caspase3，MMP2，TIMP-2的表达和荧光定量PCR从基因水平检测Caspase3，MMP2的表达情况。结果HLA-G在JEG-3细胞中呈高表达，主要定位在细胞膜表面。体外靶向性验证实验表明，mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡能与高表达HLA-G蛋白的JEG-3细胞特异性结合，增加纳米微泡在细胞的聚集和被细胞吞噬。在体外治疗实验中，与其他组相比，HIFU+mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组JEG-3细胞凋亡率最高，细胞明显阻滞在S期。Bax和Caspase3的表达在HIFU+mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组明显高于其他组，Bcl-2蛋白表达低于其他组。HIFU+mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组细胞侵袭能力明显减弱，MMP2的表达在所有组中最低，TIMP-2的表达明显高于其余各组。结论mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡靶向性好，能够改变靶区域周围声环境，增强超声的空化效应和机械效应，同时超声又能促进纳米微泡中化疗药物的释放。HIFU联合mAbHLA-G/MTX/PLGANBs很大程度的抑制了JEC-3细胞的增殖和侵袭，其作用机制可能是通过影响凋亡和侵袭相关蛋白的表达来完成的。第三部分载MTX靶向纳米微泡增效HIFU消融对滋养细胞作用的体内实验研究目的验证HLA-G在JEG-3细胞裸鼠皮下移植瘤模型瘤组织内的表达和定位。评价mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡在体内的超声显像效果和体内靶向性。研究mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡协同HIFU消融技术对JEG-3细胞裸鼠皮下移植瘤模型的治疗效果和远期生存情况的分析。方法143只BALB/C雌性裸鼠，JEG-3细胞以1~2×106浓度皮下注射于裸鼠背部，构建裸鼠皮下移植瘤模型，肿瘤直径约0.8~1.0cm时可用于后续实验。取瘤组织块石蜡包埋切片，采用免疫组化法检测HLA-G的表达和定位。经尾静脉注射mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡，在注射前和注射后（0h和24h）分别观察瘤组织区域的超声显像情况。经尾静脉注射DiI-mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡，采用小动物活体荧光成像技术观察不同时间点（3h，24h，48h）靶向载药纳米微泡在荷瘤鼠体内的分布情况，并在不同时间点取瘤组织块冰冻切片观察纳米微泡的分布。体内评价mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡增效HIFU消融的效果，120只荷瘤鼠随机分为12组（n=10）：（1）NS组，（2）空白PLGANBs组，（3）MTX/PLGANBs组，（4）MTX组，（5）mAbHLA-G/PLGANBs组，（6）mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组，（7）HIFU+NS组,（8）HIFU+空白PLGANBs组,（9）HIFU+MTX/PLGANBs组（,10）HIFU+MTX组，（11）HIFU+mAbHLA-G/PLGANBs组，（12）HIFU+mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组。HIFU消融后立即观察各组（7-12组）中瘤组织的灰度变化和取瘤组织测量消融体积。12组在处理完成后24h取瘤组织做HE染色，TUNEL检测凋亡，PCNA评价肿瘤细胞增殖抑制情况。每组余下5只荷瘤鼠用于观察肿瘤的生长情况和进行生存分析。结果HLA-G在JEG-3细胞皮下移植瘤组织中高表达，定位于细胞膜和细胞浆中。mAbHLA-G/MTX/PLGA超声造影剂在体内能稳定显影，并能特异性的到达靶组织，提高靶区域纳米微泡的聚集浓度和停留时间，增加化疗药物在靶区域的释放浓度。mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡能明显增强HIFU消融，HIFU+mAbHLA-G/MTX/PLGANBs组消融后灰度变化显著，瘤组织消融体积明显大于其他组。HIFU联合mAbHLA-G/MTX/PLGANBs有效抑制了肿瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡，延长荷瘤鼠的生存周期（中位生存期=58天）。结论mAbHLA-G/MTX/PLGA通过改变靶区域声环境，增强HIFU的消融效果，同时HIFU的热效应提高了mAbHLA-G/MTX/PLGA纳米微泡中化疗药物的释放，协同靶向杀灭了残余瘤细胞，抑制了肿瘤的生长和转移。mAbHLA-G/MTX/PLGA超声造影剂联合高强度聚焦超声为临床胎盘植入和滋养细胞疾病的治疗开辟了一条全新的道路。
【作者】张雪梅；
【导师】漆洪波；
【作者基本信息】重庆医科大学，妇产科学，2014，博士
【关键词】甲氨蝶呤；靶向纳米微泡；超声显影；多功能；凋亡；侵袭；滋养细胞；HIFU；纳米微泡；活体荧光成像；HIFU消融；超声造影剂；残余瘤；

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